HPLC Nedir?

Kromatografi, bir karışım içerisinde bulunan maddelerin; biri hareketli diğeri ise sabit iki faz arasında ayrıştırılması işlemidir. Kromatografi işlemi için yüzlerce farklı teknik kullanılmaktadır. HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi) ise kromamatografi tekniklerinden en yaygın olarak tercih edilendir. HPLC yönteminin sağladığı avantajlar aynı zaman da kromamatografi sahasını genişletmektedir.

HPLC çalışma prensibi, sıvı içerisindeki çözünmüş bileşenlerin, kolon içerisindeki katı bir destek üzerindeki sabit faz ile değişken diğer maddelerin hızlı hareketi sonucunda, bu bileşenleri farklı zamanlarda ne zaman kolonu terk ettiği gözlenmesi temeline dayanmaktadır.

HPLC fiyatları, işlemin yapıldığı sağlık kuruluşunun fiyat politikasına bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. İşlem öncesinde ve sonrasında yapılacak ek uygulamalar, fiyat üzerinde etkiye sahip diğer faktörler arasındadır.

HPLC Çeşitleri 

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi dört farklı şekilde kullanılmaktadır. Bunlar sırasıyla;

İyon Değişimi Kromatografisi: HPLC çeşitlerinden biri olan iyon değişiminin temel mantığı anyon ile katyon değişimidir. Sıvı çözeltisindeki iyonik gruplar ile iyon değiştiricideki belirlenen iyon gruplarının değiştirilmesi esasına dayanmaktadır.

Moleküler Eleme Kromatografisi: Moleküler eleme işleminin temel mantığı ise sıvı çözeltisinde yer alan moleküllerin büyüklüğüne göre ayrışım yapılmaktadır. Büyük moleküller, kolon kısmından daha önce ayrılmaktadır. Protein ve diğer makromoleküllerin boyutları baz alınarak ayrıştırma işlemi yapılmaktadır.

Moleküler eleme kromatografisi bir diğer adıyla jel filtrasyon kromatografisi olarak da bilinmektedir. 

Affinite Kromatografisi: Bu kromatografi türünde ayrıştırma işlemi yerine saflaştırma yapılmaktadır. Katı bir destek materyalinin üzerine ligalandın kovalent (bir tür kimyasal bağ) olarak immobilize (hareketsiz) şekilde eklenmektedir. Bu işlemlerin tümü saflaştırma işlemi olup, affinite kromatografisi olarak bilinmektedir.

Adsorbsiyon Kromotografisi: Adsorbsiyon, HPLC cihazına uygun olan karışımların sıvı veya gaz halinde bulunması üzerine katı faz üzerinde tutulmasına denilmektedir. Bu işlemde katı olan sabit faz diğer sıvı veya gaz halindeki maddeler ise hareketlidir.

HPLC Neden Kullanılır?

HPLC, bilinen ayırma teknikleri arasında en fazla kullanılan yöntemdir. Bu yöntemin daha fazla tercih edilmesini sağlayan belli başlı özellikleri bulunmaktadır. Özellikler;

• Yüzlerce farklı bileşene karşı duyarlı bir cihazdır.
• Kantitatif (ölçülebilir ve nicel olan) maddelerin türü ve miktarı kolay ayarlanabilmektedir.
• Bu cihazın yaygın olarak tercih edilmesinin en önemli sebebi ise sanayi ve bilim alanında birinci derece tüketim malzemelerinin ayrıştırılmasına kolayca uygulanabilir olmasıdır.
• Hem uçucu hem de sıcaklığa karşı duyarlılığı olmayan ürünlerin ayrıştırılmasına imkan sağlamaktadır.
• HPLC ile yapılan ayrıştırma işlemlerinde doğruluk oranı yüksektir.
• Bu cihaz ile yapılan ayrıştırma işlemlerinde, yeterli verilerin elde edilememesi halinde testin tekrarlanabilme şansı bulunmaktadır.

HPLC Kullanım Alanları

Günümüz şartları altında HPLC cihazı ve testi, sağladığı avantajlar ve kolaylıklar sayesinde vazgeçilmez bir araç olarak kabul görmüştür. Organik, inorganik ve biyolojik numune türlerini ayırabilmek için laboratuvar ortamında kullanılmaktadır.

• İlaçların ayrıştırılması işleminde kullanılmaktadır. (Antibiyotikler, sedatifler ve analjezikler gibi)
• Gıda maddelerinin ayrıştırılmasında tercih edilmektedir. (Antioksidanlar ve suni tatlandırıcılar gibi)
• Biyokimyasallar ürünlerin ayrıştırılmasında önemli fayda sağlamaktadır. (Proteinler, aminoasitler, lipitler ve karbonhidratlar)
• Sanayi alanında kullanılan endüstriyel kimyasalların ayrıştırılmasında kullanılabilmektedir.
• Klinik tıpta yaygın kullanılan bir yöntemdir. (Safra asitleri, ürenin özüt kısmı ve östrojenler) 

HPLC Nasıl Uygulanır?

• HPLC işlemi uygulanacak olan karışımın sıvı olması gerekmektedir. Bu cihazın birincil öncülüdür. 
• Sıvı belirlendikten sonra spesifik (bu sıvıya özgü) bir kolon belirlenmektedir. 
• Spesifik kolon yanı sıra, ölçüm yapılması beklenen bileşenin kolon içerisinde tutulması için durgaz faz solüsyonu ayarlanmaktadır. 
• Ölçümü yapılacak olan bileşen kolon içerisinde kalırken; diğer çözeltiler cihazın atık bölümünden dışarı atılmaktadır.
• Cihazın kolon kısmına belirlenen mobil faz solüsyonu uygulanıp ardından çözeltide meydana gelen değişiklikler kaydedilmektedir.
• Mobil faz ile birlikte kolon dışına atılan çözelti verileri ile mobil fazdan daha sonra kolondan ayrılan çözelti değerleri karşılaştırılmaktadır. HPLC analizleri mantığı durgun faz ile hareketli faz arasındaki göç olayıdır. 
• HPLC testi ölçümü yapılması beklenen karışımın katı olması halinde uygun solüsyonlar kullanılarak cihaz için kullanılabilir konuma getirilmesi gerekmektedir. 

HPLC Cihazı Birimleri

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi işleminde, ayrılması beklenen çözelti 7 farklı kısımda hareket etmektedir. Bu kısımlar, 

Çözücü Şişeleri: HPLC cihazına eklenecek olan çözeltilerin koyulduğu şişelerdir. Bu şişeler genellikle cam veya paslanmaz çelik kaplar olmaktadır. Bu şişelerin kaliteli olması elde edilecek sonuçların güvenirliliği açısından önem taşımaktadır.

Degasser: HPLC cihazının mobil faz kısmında hava kabarcıkları ile karşılaşılması halinde pompa ve kolon kısımlarında sorun yaşanmaktadır. Degasser, bu hava kabarcıklarının giderilmesi için kullanılan bir sistemdir.

Pompa: HPLC cihazının en önemli kısımlarında biri pompadır. Pompa sayesinde sistem içerisine eklenen çözeltilerin düzenli olarak akışı sağlanmaktadır. Bu çözeltiler enjektör, kolon ve dedektör boyunca ilerleme göstermektedir. Örneğin, HPLC cihazındaki pompa için bir benzetme yapılacak ise insan vücudunda yer alan dolaşım sistemi denilebilmektedir.

Enjektör: HPLC'nin kısımlarından biri olan enjektör, çözeltinin sabit faz öncesinde mobil faza enjekte edilmesi için kullanılmaktadır. Enjektör, manuel ve kumandalı olmak üzere iki farklı türdedir. Enjektör kısmının donanımlı ve güncel olması halinde soğutma, ısıtma, seyreltme ve karıştırma gibi özellikleri bulunmaktadır.

Kolon Fırını: HPLC cihazında ölçümü yapılacak olan numunelerin belirli bir sıcaklıkta olması gerekmektedir. Bu sebeple kolon fırını numuneleri ve ortamın sıcaklığını bu doğrultuda ayarlamaktadır.

Kolon: HPLC cihazının yapı taşlarından biri olan kolon, çözelti içerisinde yer alan bileşenlerin birbirinden ayrıştırılmasında sorumludur. Kolonların iç çapı 2-5 mm, uzunluğu ise 30-300 mm aralığında değişmektedir. Kolonun dolgu maddeleri, şekli, por çapı, fonksiyonel bağlanma şekilleri ve karbon yükü gibi özellikleri numunelerin doğru ayrıştırılması açısından önem taşımaktadır.

Dedektör: Dedektör üzerinden geçen maddelerin cinsi ve miktarları bilgisayar üzerinde kaydedilmektedir. Dedektör, ayrıştırılan maddeler hakkında bilgi aktarmaktadır.