Flow Sitometri Nedir?

Akış sitometrisi olarak da adlandırılan Flow sitometri; hücre yüzeyi ve hücre içi moleküllerin gen dizilişini analiz etmek, heterojen bir hücre popülasyonunda farklı hücre tiplerini karakterize etmek ve tanımlamak, izole alt popülasyonların saflığını değerlendirmek, hücre boyutunu ve hacmini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bunun yanında tek hücrelerin aynı anda çok parametreli analizine imkan tanır. Flow sitometriler çoğu tıp merkezinde ve biyolojik araştırma enstitülerinde bulunur.

Flow sitometri, proteinleri saptayan floresan etiketli antikorlar veya hücre ile ilişkili spesifik moleküllere bağlanan ligandlar (biyomoleküler bağlanarak kompleks bir yapı oluşturan bileşik) tarafından üretilen floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılır. Boyama kültürü diye bilinen bir prosedür, hücre kültürü ya da hücre kodu örneklerinden tek hücreli bir süspansiyon yapılmasıdır. Bu prosedürden sonra hücreler etiketsiz tüplerde, florokrom etiketli antikorlar içeren tüplerde veya mikrotitre plakalarında inkübe (mikroorganizmaların üreyebileceği ideal sıcaklıkta, etüv veya inkübatör diye adlandırılan bir cihazda bir miktar bekletilmesi) edilir. Ardından flow (akış) sitometrisinde analiz edilir.

Flow Sitometri Kullanım Alanları

Flow sitometrisi, fenotiplemeden (dış yapı) hücre sağlığı ve canlılığına kadar çok sayıda hücre analizi uygulamasında kullanılabilen güçlü bir araçtır. Flow sitometrisinin en büyük iki avantajı, aynı örnek üzerinde çok sayıda parametreyi ölçebilmesi ve birkaç saniye içinde milyonlarca hücreden bilgi toplama yeteneğine sahip olmasıdır.

Flow sitometri, biyomedikal bilimlerde yaygın bir şekilde kullanılır ve araştırmacının sıvı bir ortamda büyük bir hücre popülasyonunun hızlı bir şekilde profilini çıkarması gereken herhangi bir senaryoda uygulanabilir. Örneğin; immünolojide akış sitometri boyutunu belirlemek ve morfolojide çeşitli bağışıklık hücreleri alt tiplerini tespit etmek ve karakterize etmek için kullanılır. Ek bilgi gerektiğinde:

• Floresan boyalarla etiketlenen ve yüksek düzeyde detaylı hücre yüzeyi antijenlerine karşı yükseltilen antikorların (farklılaşma kümeleri) tespiti,
• Daha büyük bir grup içindeki alt popülasyonları daha iyi tanımlama ve ayırma,
• Özelleştirilmiş flow sitometriler, hücreleri sıralama ve deney sonrası kullanım için alt kümeleri kurtarma,
• Tüm hücre boyunca veya çekirdek yapısında protein ekspresyonu (fonksiyonel protein üretimi) ,
• Translasyon (koda uygun şekilde ribozomlarda gerçekleştirilen bir polipeptit veya amino asit sentezi süreci) sonrası protein değişiklikleri,
• Hücre çoğalması ve aktivasyonunun analizi,
• Heterojen bir örnek içerisindeki farklı hücre alt kümelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu ,
•  Hücre kültüründe virüs, bakteri ve hücre sayımı,
• Mikroorganizma (hücre içi bakteri, virüs, bakteri ve alg) sayısı ve tür analizi yapılması
• Hücreler arası serbest kalsiyum ölçümü,
• Hücre pH ölçümü,
• Hücre büyüme dinamikleri, eğrilerinin çıkarılması için kullanılabilir.

Flow sitometri sıklıkla hematoloji alanında da veri edinebilmek için kullanılmaktadır. En sık kullanım alanları ise şöyle sıralanabilir:

• Lösemik hücrelerin immünfenotiplemesi,
• Hücrenin DNA içeriğinin ve hücre döngüsünün analizi,
• Hematopoetik kök hücrelerin sayılması ve alt gruplarının belirlenmesi,
• Hücre canlılığının tespit edilmesi, apoptoz ile ilgili araştırmalar,
• Çoklu ilaç direncinin(MDR) tespit edilmesi,
• Hücresel immun yanıtın belirlenmesi,
• Trombosit çalışmaları ,
• Trombosit ürünlerine bulaşmış lökositlerin sayılması,
• Hedef olarak seçilen hücrelerin floresanla işaretlenerek saflaştırılması ve diğer uygulama alanlarıdır.

Flow sitometri, memeli canlılar için geliştirilmiş bir uygulama olsa da bireysel hücrelerin çeşitli fonksiyonel özelliklerini tayin etme yeteneği nedeniyle deniz mikrobiyal ekolojisi alanında da kullanılabilir.

Flow Sitometri Çalışma Prensibi

Flow sitometrisindeki temel kısımlar şunlardır;

• Akışkan sistemi (fluidik sistem): Akış sitometrisinde, akış hücresine örnek numunenin taşınmasını sağlayan bileşenler fluidik sistemdir.
• Lazerler
• Optik sistem: Flow sitometri cihazının etrafındaki ışığı toplamak ve hareket ettirmek için kullanılan uyarma ışık kaynakları, lensler, filtreler ve foto akımı oluşturan algılama sistemlerinin tümü optik sistemin görevidir.
• Dedektörler
• Elektronik ve bilgisayar sistemi: Akış sitometrisinin beyni olarak ifade edilen elektronik sistemin görevi, dedektörden gelen foto akımının sayısallaştırılması ve sonraki analiz için kaydedilmesidir.

Flow sitometrisinin çalışma mekanizması şöyledir;

• Tipik bir flow sitometri uygulaması, tek hücreli bir süspansiyondaki floresan etiketli hücrelerle başlar. Bunun için her türden partikül içeren bir numune kullanılabilir.
• Numune akış flow sitometrisine yerleştirildikten sonra cihaza alınır.
• Hücreler buradan kılıf sıvısı adı verilen fizyolojik bir tampon ile çevrelenir.
• İlk numune boru sistemi, pompalar ve valflerden analiz için geçer. Ardından tek dosyalı hücre akışı halinde düzenlenir.
• Akış hücresi (akış odası olarak da adlandırılır), numunelerdeki hücrelerin (parçacıkların) tek bir dosyayı hizalamasına izin verir. Bu adım tek hücre analizi için kritiktir.
• Hücrelerin lazer ışı ile etkileşime girdiği yere sorgulama noktası (lazer müdahalesi olarak da adlandırılır) denir. Eylemin gerçekleştiği yer burasıdır Lazer ışını tek bir hücreyi aydınlattığında, ışığın bir kısmı hücre içindeki fiziksel yapılara çarparak ışığın dağılmasına neden olur. Bu ışık dağılımı ölçülebilir. Göreceli hücre boyutu ve hücre içindeki yapılarla ilişkilendirilebilir.
• Neredeyse eş zamanlı olarak lazerden gelen ışık, hücre ile ilişkili tüm floroforları uyarır ve bu da bir floresan emisyonu üretir.
• Tüm bu ışık dedektör tarafından toplanır ve akış sitometrisi nin elektronik bileşeni aracılığıyla işlenir.
• Sorgulama noktasından geçtikten sonra, hücreye artık ihtiyaç kalmaz ve akışkan sistemi tarafından atık konteynerine taşınır.

Flow Sitometri Nasıl Yorumlanır?

Flow sitometri cihazı ve tekniği oldukça hızlı bir şekilde çok kısa sürede binlerce hücre hakkında detaylı veri sağlar. Flow sitometride, hücrenin büyüklüğü, hücrenin iç yapısı (granülaritesi), ve hücrede incelenmek istenen antijene ait işaretlenen monoklonal antikorun floresansı ölçülmektedir.

Akış sitometrisi, hücreleri saymak ve tanımlamak için kırılan veya yayılan ışığı kullanır. Flow sitometri cihazında bir sıvı içinde yer alan her bir hücre veya partikül lazer demetinin içinden geçerken saptırma ve geçirme şeklinde okunurken yayınlanan floresan ışığı bir araya getirilip, optik filtreler ve aynalar tarafından farklı dalga boylarına göre ayrılarak, bilgisayar ortamına aktarılır.

Flow sitometrisi tarafından oluşturulan grafiklerde her bir hücre ayrı bir veri noktasını oluşturur. Eksenler, yapılan deneye göre özelleştirilebilen bir floroforun yoğunluğunu temsil eder ve genellikle logaritmik veya iki üstel "mantık" ölçeğinde temsil edilir. Hücrelerin bir seferde iki floroforla eşlenmesi ile veriler oluşur ve analiz edilir. Hücre popülasyonları genellikle her floroforda pozitif ve negatif popülasyonlar olarak görünür. İstenilen özelliklere sahip hücre popülasyonu daha sonra yazılım tarafından "geçitlenir" ve başka bir florofor setiyle ikinci bir grafiğe taşınır. Bu analiz, tüm floroforlar yorumlanana ve kullanıcıya ilgili hücre popülasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sunulana kadar tekrar edilir. Bu işlem aynı zamanda karışık bir başlangıç çözeltisinden zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonu elde etmek için sınıflandırma işlemidir.

Temel olarak  bir Flow sitometri cihazından hücrelerin; ileri saçılma grafiği ile yaklaşık büyüklüğü, yana saçılma grafiğiile yaklaşık granülitesi ve floresans grafiği ile yaklaşık floresans miktarı hakkında bilgiler edinilir.

İleri Dağılım (İleri Saçılım) Grafiği

İleri saçılan ışık, akış kanalındaki bir hücre tarafından kırılır ve ışık yolu boyunca devam eder (ışığın başlangıçta hareket ettiği yönde). İleri saçılan ışık, ışık yolundaki bir sensör tarafından algılanır ve genellikle partikül boyutunu belirlemek için kullanılır.

İleri saçılmış ışık, daha çok ışık yolundaki nesnenin boyutunu tespit etmek için kullanılır. Daha büyük nesneler, daha küçük nesnelere göre daha ileri saçılmış ışık üretir ve daha büyük hücreler daha güçlü bir ileri saçılma sinyaline sahip olur.

Yan Dağılım (Yan Saçılma) Grafiği

Yana yayılan ışık, aydınlatma kaynağından akış kanalına geçer. Hücreler tarafından orijinal ışık yolunun dışında bir yönde kırılır. Yandan saçılan ışık, orijinal ışık yoluna dikey olarak konumlandırılmış olan bir sensör tarafından algılanır.

Yandan saçılan ışık genellikle ışık yolundaki hücrenin tanecik yapısı ve karmaşıklığı ile ilgili bir belirleme yapmak için kullanılır. Nötrofiller gibi büyük miktarda iç karmaşıklığa sahip yüksek taneli hücreler, düşük taneciklik ve karmaşıklığa sahip hücrelere göre daha fazla yana saçılmış ışık ve daha yüksek yana saçılma sinyali üretir.

Floresans Grafiği

Floresan ışık uyumlu bir dalga boyu lazeriyle uyarıldıktan sonra floresan molekülleri tarafından yayılır. Floresan ışık, hücre üzerindeki belirli bir yapıyı etiketlemek için kullanılan floresan boyalardan veya floresan etiketli antikorlardan kaynaklanabilir.